HPLC

Kromatografi merupakan teknik pemisahan zat-zat terlarut oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan senyawa ini melewati suatu kolom kromatografi. Awal mula kromatografi adalah penemuan kromatografi kolom dan kromatografi kertas yang dibuat dengan mengelusikan bahan kimia (solvent) dengan fase diam kertas pada kromatografi kertas dan silika pada kromatografi kolom. Analisis ini bisa dijadikan analisis kualitatif untuk mengetahui ada tidaknya analit yang kita identifikasi. Lebih lanjut, untuk kromatografi kolom dapat dianalisis kadarnya secara kuantitatif dengan menggunakan metode spektrofotometri. sayangnya, dewasa ini metode tersebut sudah ditinggalkan karena sangat sulit dan membutuhkan waktu yang relatif lama. 

Gambar kromatografi kolom 

                                                                                                          

  Gambar kromatografi kertas

Seiring berjalannya waktu, pengembangan kromatografi semakin pesat. Sekarang ini kita mengenal alat instrument berbasis kromatografi yang lebih canggih seperti GC (Gas Chromatography) dan HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Keduanya terbukti mampu meng-cover hampir sebagian besar analisis kuantitatif senyawa organik. Penggunaan keduanya sangat luas di berbagai industri dari mulai minyak, gas, farmasi, hingga ke produk makanan. Detektor yang dapat digunakan pun sudah banyak, yang paling awam adalah detektor flueresense (FLD) dan detector UV-vis atau Diode Array Detector (DAD). 

Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapiskan zat berpori. Pemakaian HPLC pada kromatografi eksklusi dilakukan dengan kolom panjang, tujuan utama kerjanya tetap sama yaitu penentuan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. Pada umumnya teknik ini dapat digunakan pada setiap metode kolom kromatografi

 Kromatografi cair kinerja tinggi berdasar fasenya dapat dibedakan menjadi fase normal dan terbalik. Fase normal menggunakan fase diam yang polar dan fase gerak non-polar. Fase terbalik menggunakan fase diam non-polar dan fase gerak polar. Fase normal jarang digunakan karena jauh lebih mahal biaya analisanya. Selain itu, kolom fase normal sangat rentan sehingga akan lebih cepat rusak.

Komponen HPLC

Injektor

Pada mulanya HPLC menggunakan injektor manual dengan syringe yang diinjeksikan oleh operator dan diatur volumenya oleh loop. karena dikerjakan manual oleh operator, resiko kesalahan metode  ini cukup besar. Seringkali operator baru sulit untuk mendapatkan hasil replikat yang bagus karena harus menperhatikan gelembung yang kemungkinan ada di syringe, kecepatan injeksi, dan lain-lain.

Sistem injektor sekarang sudah otomatis. Ini memungkinkan untuk mendapatkan hasil yang lebih konsisten. Autoinjector-lah yang mengatur pengambilan sample sehingga galat dari analisa dapat ditekan. Sebaiknya, injector harus dikalibrasi untuk mengecek kehandalan dari alat tersebut secara berkala.

Pompa

Alat ini sangat penting pada system HPLC karena berpengaruh pada kestabilan waktu retensi dan pemisahan yang tajam antar peak kromatogram. Titik kritis dari pompa adalah kontinuitas dari pompa. Jika pompa alirannya tersendat sendat akan mengakibatkan pemisahan yang tidak sempurna. Saat ini yang digunakan adalah pompa piston. Pengaturan dan pencampuran dari fase gerak dilakukan di kolom mixing.  

Kolom

Kolom adalah bagian utama dari HPLC. Fase diam yang akan digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang akan dianalisa. Selama ini sudah dikenal berbagai macam kolom, dari non polar, polar, penukar ion dan Perkembangan terbaru dari kolom HPLC adalah kolom HILIC (Hydrofilic Lipofilic Column) kolom ini bisa digunakan untuk senyawa yang suka air (polar) dan suka lipid (non polar). Aplikasi yang sudah digunakan adalah untuk analisa melamine dalam feed.

 

Detektor

Detektor adalah alat yang akan mendeteksi sinyal keberadaan analit. Detektor yang paling lazim digunakan adalah detektor fluorosense dan DAD (Diode Array Detektor), yang paling mutakhir adalah detektor MS namun tidak akan dibahas disini.

Detektor DAD bekerja pada panjang gelombang yang sangat lebar pada area UV-Vis. Hampir semua senyawa dapat dideteksi dengan detektor ini karena rentang wavelength yang lebar. Keunggulan lainnya, DAD dapat mengkonfirmasi hasil yang dilakukan di instrumen lain seperti GC-MS. Hal ini biasa dilakukan seperti dalam penetapan Azo dyes. DAD digunakan untuk melihat spektrum dari suatu senyawa karena tiap senyawa mempunyai spektrum yang berbeda. Kelemahan detektor ini bekerja optimal pada level ppm.

Detektor fluorosense dapat digunakan untuk senyawa yang dapat menghasilkan pendar fluorosense. Aplikasi yang saat ini digunakan antara lain untuk penetapan Aflatoksin, Okratoksin, dan lain-lain. Keunggulan dari detektor ini adalah mempunyai limit deteksi di level ppb. Ini memungkinkan untuk penentuan senyawa-senyawa organik sekelumit.  

Kegunaan HPLC

setelah mengetahui prinsip, sistem kerja dan bagian-bagian dari HPLC, berikut beberapa rangkuman penggunaan HPLC. 

-Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis

—-Analisis ketidakmurnian (impurities)

—-Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil)

—-Penentuan molekul-molekul netral, ionkc, maupun zwitter ion

—-Isolasi dan pemurnian senyawa

—-Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama.

—-Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sedikit (trace elements), dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri.