Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi adalah istilah umum untuk bermacam-macam teknik pemisahan (separasi) yang berdasar pada partisi sampel diantara fase gerak, yang bisa merupakan gas atau cair dan fase diam (Johnson dan Stevenson, 1978). Kromatografi bertujuan untuk memisahkan senyawa yang akan dianalisis dari matriks sampelnya.

Kromatografi Cair (Liquid Chromatography) adalah bagian dari teknik pemisahan senyawa dengan menggunakan fase gerak cair. Salah satu bentuk aplikasi dari kromatografi cair adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi menurut polar atau tidak polarnya fasa diam dibagi menjadi dua yaitu KCKT fase normal yaitu dengan menggunakan fase diam polar dan fase gerak nonpolar dan KCKT fase terbalik yaitu dengan menggunakan fase diam non polar dan fase gerak polar.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi sekarang banyak digunakan untuk menganalisis berbagai macam senyawa. Menurut Johnson dan Stevenson,  (1978) KCKT memiliki keunggulan-keunggulan antara lain  :

1.      cepat.

2.      sensitif.

3.      kolom dapat di pakai kembali (dapat diapakai dengan jangka waktu lama).

4.      detektor tidak merusak sampel.

5.      daya pisahnya baik.

Instrumentasi KCKT

            Pada dasarnya Kromatografi Cair Kinerja Tinggi terdiri dari sistem pompa, injektor, kolom separasi, detektor, dan penampil data. 

1. Tempat Pelarut (fasa gerak)

Pelarut yang akan digunakan sebagai fase gerak diletakkan pada tandon. Pada sebagian besar sistem pompa aliran tetap, tandon pelarut berada pada sisi pompa bertekanan rendah sehingga pelarut disedot dari tandon dan didorong keluar memasuki kolom. Selang/pipa menghubungkan pelarut dengan sistem pompa biasanya diberi filter untuk menyaring kotoran agar tidak masuk ke dalam kolom dan dilengkapi dengan pembuang gas (degasser). Fase gerak dapat berupa air, pelarut organik, buffer atau campurannya dengan perbandingan tertentu.

Pemilihan fase gerak merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi efektifitas pemisahan. Fase gerak yang akan digunakan mempunyai syarat-syarat antara lain (Johnson dan Stevenson, 1991) :

a.       murni, tanpa cemaran

b.      tidak bereaksi dengan cemaran

c.       sesuai dengan detektor

d.      dapat melarutkan cuplikan

e.       mempunyai viskositas rendah

f.       memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan.

2. Sistem Pompa

Pada kromatografi kolom, digunakan gaya gravitasi untuk mengalirkan fase gerak. Namun pada KCKT untuk mengalirkan fase gerak digunakan pompa. Dengan menggunakan alat ini, KCKT dapat bekerja lebih cepat dibandingkan dengan kromatografi cair yang lain.

Sistem pompa dapat mengatur secara otomatis perbandingan pencampuran pelarut sehingga dihasilkan pencampuran yang baik. Sistem pompa juga mampu melakukan elusi isokratik dan elusi gradien. Elusi isoktatik adalah elusi yang perbandingannya konstan selama pengukuran berlangsung sedangkan elusi gradien adalah elusi yang komposisi fase geraknya berubah.

Pompa didalam sistem KCKT harus menghantarkan aliran pelarut yang tetap dan terulangkan ke dalam kolom. Pompa harus tahan terhadap semua jenis pelarut. Selain itu, pompa harus memiliki volum tertahan yang minimum sehingga memungkinkan pergantian pelarut dengan cepat dan elusi landaian yang efisien (Gritter, Bobbit dan Schwarting,  1991).

3. Injektor

Injektor memiliki 6 terminal yang berfungsi sebagai saklar. Pada saat posisi "LOAD" pompa langsung terhubung pada kolom separasi dan sampel terisi kedalam stainless steel tube (loop) , pada posisi "INJECT" pompa terhubung langsung dengan stainless steel tube (loop) dan mengalir kedalam kolom separasi.  Sistem ini memungkinkan untuk membuang sisa kelebihan sampel yang akan diinjeksikan sehingga diharapkan volume sampel yang masuk kedalam kolom lebih teliti.

4. Kolom Separasi

Kolom merupakan komponen yang vital pada analisis kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan bergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Misalnya, oktadekil (C₁₈) polimer paling baik untuk senyawa nonpolar, seperti alkena dan senyawa aromatik berinti banyak dan oktadekil (C₁₈) monomer baik untuk kolom fase balik serbaguna (Johnson dan Stevenson, 1991).

Pada umumnya KCKT menggunakan butir berpori dengan garis tengah 3 -10µm. Bahan tersebut menghasilkan daya pisah terbaik serta kapasitas tertinggi, tetapi mempunyai kekurangan yaitu memerlukan tekanan yang tinggi untuk menjalankannya (Gritter, Bobbitt, dan Schwarting, 1991). kolom KCKT tidak terlalu panjang seperti pada kolom Kromatografi Gas karena keefisienan yang tinggi dan akan diperlukan tekanan lebih tinggi jika kolom terlalu panjang. Kolom KCKT biasanya memiliki panjang 5-25 cm. 

5. Detektor

Sebagian besar detektor KCKT adalah spektrofotometer alir-lewat yang merekam pada panjang gelombang tertentu. Pada gelombang itu pelarut sedikit sekali atau sama sekali tidak menyerap sinar, sedangkan cuplikan menyerap dengan kuat (Gritter, Bobbitt, dan Schwarting, 1991). Detektor yang dipakai pada pengukuran menggunakan KCKT adalah detektor UV, fluorosensi, serapan inframerah, indeks bias, ionisasi nyala dan elektrokimia. Namun, pada penetapan Okratoksin A digunakan detektor fluorosensi.

Keuntungan utama detektor fluorosensi yaitu batas deteksi lebih baik untuk banyak senyawa. Namun, tentu saja detektor ini hanya cocok untuk senyawa yang bisa berfluorosensi. Pelarut yang cocok untuk detektor fluorosensi adalah pelarut yang biasa dipakai untuk detektor UV namun tidak mengandung halogen. Pelarut seperti CH₂Cl₂ dan CHCl₃ cenderung meredam atau mengurangi fluorosensi.

Cahaya dari lampu sumber melewati sistem optik untuk memfokuskan berkas sinar dan memilih panjang gelombang untuk mengeksitasi cuplikan. Berkas sinar difokuskan pada sel cuplikan kuarsa. Jika ada molekul yang berfluorosensi, maka cahaya yang panjang gelombangnya berbeda dengan panjang gelombang yang dipakai untuk mengeksitasi molekul dipancarkan ke segala arah. Sistem optik emisi mengumpulkan dan menyaring cahaya itu, yang kemudian difokuskan pada detektor (Johnson dan Stevenson, 1991).

6.   Penampil Data

Sinyal yang dihasilkan dari detektor ditampilkan secara komputerisasi melalui pik-pik. Sekarang penampil data juga telah dilengkapi dengan sistem pembacaan luas area dan tinggi area dari pik yang dihasilkan sehingga mempermudah analis dalam menetapkan suatu senyawa. Ada beberapa cara untuk menghitung atau mengukur luas puncak, antara lain : metode planimetri, triangulasi, gunting timbang, integrasi cakram, dan komputerisasi.

Jenis	Ketepatan
Planimetri Triangulasi Gunting Timbang Integrasi Cakram Komputer	4% 4% 2% 1% 0,5% dan lebih baik

            Sumber : Johnson dan Stevenson, 1991

Metode seperti planimetri dan gunting timbang sangat tergantung pada ketrampilan operatornya. Bahkan untuk metode gunting timbang, keseragaman bobot kertas gaftar juga menjadi syarat penting. Fdapat dikatakan pengukuran luas area menggunakan komputer sangat membantu dalam meningkatkan kemudahan, ketepatan dan ketelitian.